强力推荐性能与知名品牌TRIZOL相媲美，价格非常实惠的总RNA抽提试剂。

总RNA提取试剂 - Total RNA Extraction Reagent

产品编号	名称	规格	价格	促销价格	说明书
A211-01	总RNA提取试剂- Total RNA Extraction Reagent	100ml	800元	400元
A211-01B	总RNA提取试剂- Total RNA Extraction Reagent	500ml	2500元	1500元

[评价] 

  　　Total RNA Extraction Reagent和知名同类产品相媲美,当然也和进口产品一样,对于绝大部分常见样品均能得到很好的抽提效果.对于特殊样品比如多酚类,多糖类含量比较高或RNA含量极低的样品,对操作要求比较严格,需要调整实验条件. 目前在上海,浙江,江苏有相当多的客户已经使用过该产品,得到相当高的评价.并与国外知名品牌相比较,得到很好的抽提效果.如下是中科院上海药物所客户的实验结果:

[简介]    

     总RNA抽提取试剂可直接用于人类、动物、植物、细菌等细胞或组织中的总RNA提取。该试剂操作简便易行， 样本在总RNA抽提取试剂中充分裂解后加入氯仿离心, 形成上清层、中间层和有机层, 然后通过收集水样层 , 用异丙醇沉淀来得到RNA。

[应用]

  ● cDNA 合成,cDNA文库构建

  ● RT-PCR,实时定量 PCR 

  ● Northern 杂交, 点杂交

  ● Poly (A)+ 文库筛选,体外翻译

  ● RNase保护分析

[内容]   

   一瓶100ml试剂,纸盒装. 4℃暗处避光保存.

[自备]

  ● 液氮 (用于动/植物组织抽提)       ● 异丙醇

  ● 氯仿      ● 75% 乙醇( 用DEPC处理过的水配制)

  ● 无RNase 水  【调配无RNA酶的水方法：将去离子水加入无RNA酶的玻璃瓶中,加入DEPC 至0.1%（v/v -DEPC/去离子水） 搅拌均匀放置过夜并高压灭菌】

（建议：为RNA实验准备单独使用的试剂,并做好标识,以避免RNA酶的交叉污染）

[注意]

    RNA酶是导致RNA降解最主要的物质,其活性很难被完全抑制,并广泛存在于人体皮肤、吐沫和各种物体的表面等,所以,预防其污染,在RNA提取过程中是十分必要的,抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。全程佩戴手套、口罩；使用无RNA酶的器皿和吸头抽提RNA;有条件的实验室可为RNA实验准备单独的房间和单独的仪器。

［步骤］

　　　　每毫升Total RNA Extraction Reagent对应样品的建议用量：

1.裂解

⑴动/植物组织: 液氮中将样品研磨成粉末，匀浆时组织样品量按照建议用量;

⑵单层贴壁生长的细胞: 吸尽培养液,在直径3.5 cm的培养板中加入1ml总RNA抽提取试剂 ,放置5～10 分钟,在放置过程中,晃动2～3 次,保证细胞裂解完全,将细胞裂解物移至离心管中。一般每20～30 cm2 加1 ml总RNA抽提取试剂,细胞量为5×106-1×107个;

⑶悬浮生长的细胞:通过离心来沉淀细胞。在总RNA抽提取试剂中用移液器反复吹打来裂解细胞。总RNA抽提取试剂 按前面中建议的用量。在加入总RNA抽提取试剂 前应避免洗涤细胞而增加mRNA 降解的可能性。破裂某些真菌和细菌可能需要使用匀浆器;样本加入总RNA抽提取试剂 后,如不立即进行后续提取步骤,可保存于 -70℃冰箱1 个月。将匀浆样品在室温下孵育15 分钟,使样品充分裂解至匀浆液较透明,如果仍有少量颗粒属于正常情况，不影响RNA 提取质量和得率。

可选步骤 Ⅰ：将匀浆液4℃,12,000g 离心5 min,取上清弃沉淀,继续下面步骤；

2.分离

按照1：5（氯仿: 总RNA抽提取试剂 ）的比例（v/v）加入氯仿。盖紧管盖,振荡混匀并将其在冰上孵育15 分钟,于4℃,12,000×g 离心15 分钟。离心后混合物分层：上清层,中间层,下层;RNA 存在于上清层中。

可选步骤 Ⅱ：如需要进一步去除杂质,以得到高纯度的RNA,可将水样层转移到一干净的离心管中。按照5：1：1【总RNA抽提取试剂 ：氯仿：饱和酚（pH4.5±0.2）】

的比例(v/v/v)加入氯仿和酚,振荡混匀15 秒。于4℃,12,000×g离心15分钟,离心后混合物仍然分层：上清层,中间层（中间层可能并不明显）,有机层。

3. RNA 的沉淀

将上清层转移到一干净的离心管中,加入等体积冰浴的异丙醇,颠倒振荡混匀,

将混合的样品在-20℃ 条件下孵育20 分钟以上,4℃,12,000×g 离心10 分钟。

RNA 沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。

4. RNA 的洗涤

弃去上清,用冰浴的75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次,按每1ml 的总RNA抽提取试剂至少加1ml 的75%乙醇的比例加入75%乙醇。颠倒洗涤离心管管壁,并旋涡振荡样品,尽可能让沉淀悬浮,4℃,12,000×g 离心5 分钟,再次去除上清,晾干沉淀。

5. RNA 的溶解

操作的最后,在阴凉处适度干燥RNA 沉淀（避免过分干燥,那样会降低它的可溶性）。用适量的无RNA 酶水或TE溶液来溶解RNA（一般可用50～100μl 无RNA 酶的水或TE 溶液溶解RNA）。抽提好的RNA,保存于 -70℃。

抽提注意事项：

①抽提含蛋白质,脂肪,多糖的样品时,例如肌肉,脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要额外的分离步骤。即匀浆后于4℃,12,000×g 离心15分钟,如有脂肪漂在最上层因可以除掉,然后将清亮的含有RNA的上层匀浆溶液转移到干净的试管中加入氯仿并继续进行后面的分离步骤。

②如台式离心机最大转速不能达到要求的离心力,则将离心时间适当延长。

［流程］

实验步骤可以简单归纳为如下流程：

        动/植物组织或培养细胞等样品

        　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓匀浆 （加入 Total RNA Extraction Reagent）

       室温孵育15min

                     ↓(可选步骤I见说明书)

            加入1/5 Total RNA Extraction Reagent体积

               的氯仿,剧烈振荡,冰上孵育15min

                     ↓离心12000xg,15min,4℃

             混合物分层:上清层、中间层和有机层

                     ↓(可选步骤II见说明书)

              取上清到新管,加入等体积冰浴异丙醇,

                  颠倒混合,-20℃放置20min以上

                     ↓ 离心12000xg,15min,4℃

          取上清,加入与Total RNA Extraction Reagent的等体积

                     的75%的冰乙醇,悬浮沉淀

                     ↓离心12000xg,5min,4℃

                取上清,适度干燥沉淀

   ↓

             用无RNase水或TE溶液(50-100ul)

                  溶解RNA沉淀

[附录]

1. RNA纯度和产量的得率

 分光光度法定量分析RNA纯度和产量的得率：

 ● 取一定量的 RNA 提取物,用25mM Tris-HCl（pH7.5）稀释n倍,已备分光光

   度测定；

 ● 用Tris-HCl 将分光光度计调零；

 ● 取100μl 稀释液进行测定,测的OD260,OD280 进行接下来的浓度及纯度的

    计算；

        终浓度 = (OD260)×(稀释倍数n)×(D260 转化因数）

        Ratio= OD260/ OD280

?    RNA 的转化因数是0.040μg/μl 每1OD260

? 注意： OD260 测得值范围：0.1 <OD260< 1.0

? Ratio：1.8～2.0 显示RNA 纯度很高

   （在使用低PH 值的RNase-free 的纯水进行溶解剂稀释,测出的结果较低）

2.关于DNA 的污染

  在大多数PCR 扩增过程中其影响不是很大,如果要进行严格的mRNA 表达量分析,我们建议在进行模板和引物的选择时：

   ●选用跨内含子的引物,以穿过mRNA 中的连接区,这样DNA就不能作为模板

     参与扩增反应;

 ●选择基因组DNA 和cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对;

 ●将RNA提取物用RNase-free 的Dnase I处理

3.实验数据

　以下结果是用 Total RNA Extraction Reagent严格按照说明书流程作出的实验结果

[问题]

1.抽提得率较低？

2.抽提的RNA有降解？