一、原理

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用EGFP作为荧光标记探针。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、试剂盒组份

三、操作步骤

1．   悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；

2．   用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×10⁵细胞；

3．   加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；

4．   加入5μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；

5．   室温、避光、反应5～15min；

6．   请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

A．  荧光显微镜观察

1．   滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；

2．   对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；

（1）         将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；

（2）         用PBS洗涤细胞两次；

（3）         在500μL 的Binding Buffer中加入2μL Annexin V-EGFP， 5 μL Propidium Iodide，混匀；

（4）         将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；

（5）         避光、室温反应5 min。

3．   将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察

Annexin V-EGFP荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

B．   流式细胞仪分析

用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。

Annexin V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测，建议使用FL3。

荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

四、注意事项

1．  Annexin V-EGFP，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。

2．  Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。

3．  本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×10^5，，不适用于检测组织样本。

4．  推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

5．   因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

五、储存        置于 4⁰C ，可保存一年

六、已发表文献

Annexin V-FITC

Hongbing Han, Qiuzhen Pan, Baolu Zhang,Jia Li, Xuemei Deng, Zhengxing Lian, Ning Li. 4-NQO induces apoptosis via p53-dependent mitochondrial signaling pathway. Toxicology. 2006 Nov 15

栾巍，黄海辉，梁后杰。a V整合素在鼻咽癌放疗群集耐受中的作用。中华肿瘤防治杂志。2006 Vol.13, No.18:1380-1383